‫آزمایش مزلسون و استال

با توجه به اینکه دنا به عنوان ماده وراثتی، حاوی اطلاعات یاخته است، این پرسش مطرح می‌شود که هنگام تقسیم یاخته، این اطلاعات، چگونه بدون کم وکاست به دو یاخته حاصل از تقسیم می‌رسند؟

‫این کار با همانندسازی دنا انجام می‌شود. به ساخته شدن مولکول دنای جدید از روی دنای قدیمی همانندسازی می‌گویند.

‫با توجه به مدل واتون و کریک و وجود رابطه مکملی بین بازها تا حد زیادی همانندسازی دنا قابل توضیح است، گرچه طرح‌های مختلفی برای همانندسازی دنا پیشنهاد شده بود.

‫۱-همانندسازی حفاظتی

در این طرح هر دو رشته دنای قبلی(اولیه) به‌صورت دست نخورده باقی مانده، وارد یکی از یاخته‌های حاصل از تقسیم می‌شوند، دو رشته دنای جدید هم وارد یاخته دیگر می‌شوند. چون دنای اولیه به‌صورت دست نخورده دریکی ازیاخته‌ها حفظ شده است به آن همانندسازی حفاظتی می‌گویند.

‫۲-همانندسازی نیمه‌حفاظتی

دراین طرح در هر یاخته یکی از دو رشته دنا مربوط به دنای اولیه است ورشته دیگر با نوکلئوتیدهای جدید ساخته شده است. چون در هر یاخته حاصل، فقط یکی از دو رشته دنای قبلی وجود دارد، به آن نیمه‌حفاظتی می‌گویند.

‫۳-همانندسازی غیرحفاظتی(پراکنده)

در این طرح هرکدام از دناهای حاصل، قطعاتی از رشته‌های قبلی و رشته‌های جدید را به‌صورت پراکنده در خود دارند.

‫کدام طرح مورد تایید قرار گرفته است؟

‫مزلسون و استال با به کارگیری روش علمی پاسخ این پرسش را به‌دست آوردند. آن‌ها فرضیه‌های متعدد ارائه شده را در نظر گرفتند و با توجه به امکانات، آزمایشی را طراحی کردند تا بتوانند به پاسخ قانع‌کننده‌ای برسند. برای شروع کار، آن‌ها باید بتوانند رشته‌های دنای نوساز را از رشته های قدیمی تشخیص دهند. آن‌ها با این هدف دنا را با استفاده از نوکلئوتیدهایی که ایزوتوپ سنگین نیتروژن(^۱۵N) دارند، نشانه‌گذاری کردند.

‫دناهایی که با ^۱۵N ساخته می‌شوند نسبت به دنای معمولی که در نوکلئوتیدهای خود ^۱۴N داردچگالی بیشتری دارند. بنابراین، به وسیله گریزانه با سرعت بسیار بالا می‌توان آن‌ها را از هم جدا کرد.

‫آن‌ها ابتدا باکتریها را در محیط دارای ^۱۵N کشت دادند. ^۱۵N در ساختار بازهای آلی نیتروژن‌دار که در ساخت دنای باکتری شرکت می‌کنند، وارد شدند. پس از چندین مرحله رشد و تکثیر در این محیط، باکتری‌هایی تولید شدند که دنای سنگین‌تری نسبت به باکتری‌های اولیه داشتند.

‫سپس این باکتری‌ها را به محیط کشت دارای ^۱۴N منتقل کردند. با توجه به اینکه تقسیم باکتری‌ها حدود ۲۰ دقیقه طول می‌کشد درفواصل ۲۰ دقیقه‌ای باکتری‌ها را از محیط کشت جدا و بررسی کردند.

‫برای سنجش چگالی دناها در هر فاصله زمانی، دنای باکتری را استخراج و در شیبی از محلول سزیم‌کلرید با غلظت‌های متفاوت و در سرعتی بسیار بالا گریز دادند: در نتیجه مواد بر اساس چگالی در بخش‌های متفاوتی از محلول در لوله قرار گرفتند.

‫همان طورکه مشاهده می‌کنید نتایج این آزمایش نشان داد که همانندسازی دنا، نیمه حفاظتی است.

‫الف) دنای باکتری‌های اولیه پس از گریزدادن، یک نوار در انتهای لوله تشکیل دادند چون هردو رشته دنای آن‌ها ^۱۵N وچگالی سنگینی داشت.

ب) دنای باکتری‌های حاصل از دور اول همانندسازی در محیط کشت حاوی ^۱۴N(بعد از ۲۰ دقیقه) پس از گریز دادن، نواری در میانه لوله تشکیل دادند. پس دنای آن‌ها چگالی متوسط داشت.

‫پ) دنای باکتری‌های حاصل از دور دوم همانندسازی(بعد از ۴۰ دقیقه) پس از گریز دادن دو نوار، یکی در میانه و دیگری در بالای لوله تشکیل دادند. پس نیمی از آن‌ها چگالی متوسط و نیمی چگالی سبک داشتند. چرا؟

‫با مشخص شدن اینکه همانندسازی به صورت نیمه‌حفاظتی انجام می‌شود، سوال دیگری مطرح شد: دو رشته دنا چگونه از یکدیگر باز می‌شوند؟ آیا هر دو رشته کاملا از یکدیگر جدا می‌شوند و سپس همانندسازی انجام می‌شود یا جدا شدن دو رشته تدریجی و همراه با آن همانندسازی انجام می‌شود؟

‫تحقیقات نشان داده است در محلی که قرار است همانندسازی انجام شود دو رشته از هم باز می‌شوند. بقیه قسمت ها بسته هستند و به تدریج باز می‌شوند.

‫عوامل و مراحل همانندسازی

‫درهمانندسازی عوامل متعددی موثرند که مهم‌ترین آن‌ها به شرح زیر است:

-مولکول دنا به عنوان الگو

‫_واحدهای سازنده دنا که بتوانند در کنار هم نسخه مکمل الگو را بسازند. این واحدها نوکلئوتیدهای آزاد داخل یاخته و سه فسفاته هستند که در لحظه اتصال به رشته پلی‌نوکلئوتید در حال ساخت، دو فسفات خود را از دست می‌دهند.

‫-آنزیم‌های لازم برای همانندسازی که ضمن بازکردن دو رشته نوکلئوتیدها را به‌صورت مکمل روبه‌روی هم قرار می‌دهد و با پیوند فسفودی‌استر به هم وصل می‌کند.

‫مراحل همانندسازی: قبل از همانندسازی دنا باید پیچ و تاب فامینه، باز وپروتئین‌های همراه آن یعنی هیستون‌ها از آن جدا شوند تا همانندسازی بتواند انجام شود. این کارها با کمک آنزیم‌هایی انجام می‌شود. سپس آنزیم هلیکاز مارپیچ دنا و دو رشته آن را از هم باز می‌کند.

‫به نظر شما برای باز شدن دورشته دنا آنزیم هلیکاز چه پیوندهایی را از هم باز می‌کند؟

‫انواع دیگری از آنزیم‌ها با همدیگر فعالیت می‌کنند تا یک رشته دنا در مقابل رشته الگو ساخته شود. یکی از مهم‌ترین آن‌ها که نوکلئوتیدهای مکمل را با نوکلئوتیدهای رشته الگو جفت می‌کند دنابسپاراز(DNAپلیمراز) است. با توجه به اینکه در محل همانندسازی، همانندسازی در دو جهت انجام می‌شود به آن همانندسازی دو جهتی نیز می‌گویند.

‫دوراهی همانندسازی

در شکل ۱۱ می‌بینید در محلی که دو رشته دنا از هم جدا می‌شوند، دو ساختار Y مانند به وجود می‌آید که به هر یک از آن‌ها دوراهی همانندسازی می‌گویند.

در فاصله بین این دو ساختار، پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته از هم گسیخته و دو رشته از یکدیگر باز شده‌اند. همچنین پیوندهای فسفودی‌استر جدیدی در حال تشکیل هستند. دنابسپاراز نوکلئوتیدها را به انتهای رشته در حال تشکیل اضافه می‌کند.

اضافه شدن یک نوکلئوتید به نوع بازی بستگی دارد که در نوکلئوتید رشته الگو قرار دارد. هر نوکلئوتید باید با نوکلئوتید روی رشته الگو مکمل باشد. هنگام اضافه شدن هر نوکلئوتید سه فسفانه به انتهای رشته پلی‌نوکلئوتید دو تا از فسفات‌های آن از مولکول جدا می‌شوند و نوکلئوتید به‌صورت تک‌فسفاته به رشته متصل می‌شود.

‫فعالیت‌های آنزیم دنابسپاراز

‫همانندسازی دنا با دقت زیادی انجام می‌شود: این دقت تاحدود زیادی مربوط به رابطه مکملی بین نوکلئوتیدها است. اگرچه آنزیم دنابسپاراز، نوکلئوتیدها را براساس رابطه مکملی مقابل هم قرار می‌دهد ولی گاهی در این مورد اشتباهی هم صورت میگیرد.

آنزیم دنابسپاراز پس از برقراری هر پیوند فسفودی‌استر، برمی‌گردد و رابطه مکملی نوکلئوتید را بررسی می‌کند که رابطه آن درست است یا اشتباه؟ اگر اشتباه باشد آن را برداشته و نوکلئوتید درست را به جای آن قرار می‌دهد. برای حذف نوکلئوتید نادرست باید بتواند پیوند فسفودی‌استر را بشکند و نوکلئوتید نادرست را از دنا جدا کند.

توانایی بریدن دنا را فعالیت نوکلئازی گویندکه در آن پیوند فسفودی‌استر می‌شکند. بنابراین آنزیم دنابسپاراز، هم فعالیت بسپارازی(پلیمرازی) دارد که در آن پیوند فسفودی‌استر را تشکیل می‌دهد و هم فعالیت نوکلئازی که در آن پیوند فسفودی‌استر را برای رفع اشتباه می‌شکند. فعالیت نوکلئازی دنابسپاراز را که باعث رفع اشتباه‌ها در همانندسازی می‌شود، ویرایش می‌گویند.

‫همانندسازی درپروکاریوت‌ها و یوکاریوت‌ها

‫در پروکاریوت‌ها که شامل همه باکتری‌ها می‌شوند، مولکول‌های وراثتی در غشا محصور نشده و فام‌تن اصلی دارای یک مولکول دنای حلقوی است که در سیتوپلاسم قرار دارد و به غشای یاخته متصل است. پروکاریوت‌ها علاوه‌بر دنای اصلی ممکن است مولکول‌هایی از دنایی دیگر به نام دیسک(پلازمید) داشته باشند. اطلاعات این مولکول‌ها می‌تواند ویژگی‌های دیگری را به باکتری بدهد مانند افزایش مقاومت باکتری در برابر پادزیست(آنتی بیوتیک)ها.

‫اغلب پروکاریوت‌ها فقط یک جایگاه آغاز همانندسازی در دنای خود دارند. در این جایگاه دو رشته دنا از هم باز می‌شوند. همانند یوکاریوت‌ها، همانندسازی دو جهتی در باکتری‌ها نیز وجود دارد یعنی از یک نقطه همانندسازی شروع و در دو جهت ادامه می‌یابد تا به همدیگر رسیده و همانندسازی پایان یابد.

‫دریوکاریوت‌ها که بقیه موجودات زنده یعنی آغازیان، قارچ‌ها، گیاهان و جانوران را شامل می‌شوند دنا در هر فام‌تن به‌صورت خطی است و مجموعه‌ای از پروتئین‌ها که مهم‌ترین آن‌ها هیستون‌ها هستند همراه آن قراردارند. بیشتر دنا درون هسته قرار دارد که به آن دنای هسته‌ای می‌گویند. در یوکاریوت‌ها علاوه بر هسته در سیتوپلاسم نیز مقداری دنا وجود دارد که به آن دنای سیتوپاسمی می‌گویند. این نوع از دنا که حالت حلقوی دارد در راکیزه(میتوکندری) و دیسه(پلاست) دیده می‌شود.

‫همانندسازی در یوکاریوت‌ها بسیار پیچیده‌تر از پروکاریوت‌ها است. علت این مسئله وجود مقدار زیاد دنا و قرار داشتن در چندین فام‌تن است که هر کدام از آن‌ها چندین برابر دنای باکتری هستند. بنابراین اگر فقط یک جایگاه آغاز همانندسازی در هر فام‌تن داشته باشند مدت زمان زیادی برای همانندسازی لازم است. به همین علت دریوکاریوت‌ها، آغاز همانندسازی در چندین نقطه در هر فام‌تن انجام می‌شود.

‫تعداد جایگاه‌های آغاز همانندسازی دریوکاریوت‌ها حتی می‌تواند بسته به مراحل رشد و نمو تنظیم شود مثلا در دوران جنینی در مراحل مورولا و بلاستولا(مرحله تشکیل بلاستوسیست) سرعت تقسیم زیاد و تعداد جایگاه‌های آغاز همانندسازی هم زیاد است ولی پس از تشکیل اندام‌ها، سرعت تقسیم و تعداد جایگاه‌های آغاز کم می‌شوند.